PCR testas

Maksimilianas Reindlis studijavo chemiją ir biochemiją LMU Miunchene ir nuo 2020 metų gruodžio yra „houseofgoldhealthproducts“ redakcijos komandos narys. Jis supažindins jus su medicinos, mokslo ir sveikatos politikos temomis, kad jos būtų suprantamos ir suprantamos.

Daugiau Maximilian Reindl įrašų Visą „houseofgoldhealthproducts“ turinį tikrina medicinos žurnalistai.

PGR tyrimai tapo neatskiriama šiuolaikinės medicinos ir molekulinės diagnostikos dalimi. Kadangi jie yra tokie tikslūs, jie laikomi „aukso standartu“. Jie gali būti naudojami įvairiose srityse - nuo patogeno aptikimo iki paveldimų ligų patikrinimo, t. Y. Visur, kur reikia patikimai aptikti net mažiausius paveldimos medžiagos pėdsakus. Čia sužinosite, kodėl PGR tyrimas yra toks tikslus, kur jis naudojamas ir kaip jis veikia išsamiai.

Kas yra PGR testas?

PGR tyrimas yra molekulinės biologijos ir medicinos laboratorinis metodas. Bandymas naudojamas tiesioginiam genetinės medžiagos aptikimui ir apibūdinimui. Ekspertai mano, kad PGR metodas yra lengvai įgyvendinamas, visuotinai taikomas ir tvirtas.

Laboratorijoje PGR tyrimas susideda iš dviejų etapų. Pirmajame etape esama genetinė medžiaga atkuriama naudojant polimerazės grandininę reakciją arba trumpai PGR. Tokiu būdu galima ištirti mažiausius DNR pėdsakus. Tai taip pat yra priežastis, kodėl PGR testai yra tokie jautrūs.

Antrame etape genetinė medžiaga atskiriama, „surūšiuojama“ ir taip apibūdinama pagal jos savybes. Taigi nustatoma smulki DNR struktūra.

Yra daug galimų panaudojimo būdų: gydytojai naudoja PGR testą, norėdami ištirti, pavyzdžiui, tepinėlius koronavirusui, kraujo donorystę dėl ŽIV ar naujagimių tikrinimą dėl galimų paveldimų ligų. Bakterines infekcijas, pvz., Tuberkuliozės sukėlėjus, arba parazitines infekcijas (maliariją) taip pat galima išsiaiškinti atliekant PGR.

Jie taip pat padeda teismo medicinoje nuteisti nusikaltėlius pagal jų genetinį pirštų atspaudą arba yra naudojami kaip tėvystės testai.

Visos šios programos yra apibendrintos terminu molekulinė diagnostika. Taigi PGR yra praktinis pritaikymas tyrimuose, diagnostikoje ir teismo medicinoje, toli nuo Sars-CoV-2 patogeno aptikimo.

(Corona) PGR testas, palyginti su greitu PGR tyrimu

Paprastai PGR tyrimas įvertinamas specializuotoje laboratorijoje. Tai reiškia, kad pavyzdinė medžiaga yra siunčiama ir ten tiriama. Rezultatas paprastai gaunamas po kelių dienų.

Įvairūs startuoliai (GNA Biosolutions, Spindiag) neseniai pristatė naujo tipo mobiliuosius bandymo įrenginius. Tam jie taip pat gavo specialius Federalinio vaistų ir medicinos prietaisų instituto (BfArM) patvirtinimus. Naudojant šiuos mobiliuosius PGR bandymo prietaisus, PGR tyrimas taip pat būtų įmanomas be specializuotos laboratorijos.

Šis metodas turi didelį potencialą, nes patikimas tyrimo rezultatas gali būti pasiektas per kelias valandas tiesiai toje vietoje, kur buvo paimtas mėginys (bandymų centre).

Kol kas negalima įvertinti, kiek tokios greito PGR bandymo sistemos vyraus praktikoje. Taip pat dar nežinoma, kaip greitai bandymų centrai bus aprūpinti visais šiais prietaisais.

Todėl artimiausioje ateityje ir toliau bus atliekami „reguliarūs“ laboratoriniai PGR tyrimai, dėl kurių tarp mėginių ėmimo ir bandymo rezultatų atsiranda tam tikras vėlavimas.

Kiek patikimas PGR tyrimas?

PGR yra patikrintas aptikimo metodas molekulinėje diagnostikoje ir medicinoje. Tai laikoma vadinamuoju aukso standartu, kurio klaidų lygis yra labai mažas. Bandymams ypač būdingas labai didelis jautrumas ir specifiškumas.

Jautrumas reiškia patikimumą, kuriuo bandymas nustato aptinkamą genetinę medžiagą.

Specifiškumas reiškia tikrumą, kuriuo remiantis nustatoma, kad aptariamos genetinės medžiagos mėginyje nėra.

Kada PGR tyrimai veikia Sars CoV-2 infekcijos atveju?

Paprastai PGR tyrimas nustato koronos infekciją likus dviem ar trims dienoms iki simptomų atsiradimo ir iki 20 dienų nuo jų atsiradimo. Net ir užsikrėtusiems žmonėms, kurie visiškai neturi simptomų, testas veikia kritiniu laiko periodu, kai jie gali užkrėsti kitus.

Atskirais atvejais tai įrodyti galima net praėjus 60 dienų po ligos simptomų atsiradimo.

Pirmąją dieną po koronos infekcijos PGR testas taip pat gali būti neigiamas, net jei yra infekcija. Tokiu atveju tepinėlio tyrimo metu gerklėje nebuvo pakankamai virusų. Tačiau, jei yra pagrįstų įtarimų dėl infekcijos, dažniausiai gydytojai kitomis dienomis atlieka kitą PGR tyrimą.

galimi klaidų šaltiniai

Praktikoje klaidų lygis DNR kopijavimo procese yra nereikšmingas. Nors DNR polimerazės niekada neveikia tinkamai, jos vargu ar atlieka vaidmenį PGR tyrimo procese.

Praktiškai galimi klaidų šaltiniai yra mėginių ėmimo procese: todėl svarbu, kad tepinėlį atliktų apmokytas medicinos personalas. Seilių ir gargalių mėginiai gali sumažinti tikslumą, nes čia atsiranda praskiedimo poveikis.

Kaip veikia PCR testas?

PGR tyrimą atlieka, pavyzdžiui, šeimos gydytojas arba specialiuose tyrimų centruose. Pirmiausia mėginį paima gydytojai arba apmokyti sveikatos priežiūros specialistai. Paprastai bandymui iš viršutinių kvėpavimo takų imamas tamponas. Paprastai tai yra burnos, nosies ir gerklės tamponas.

Taip pat galima skalauti skalavimo tirpalu. Kraujo mėginys yra netipiškas vainikui aptikti, tačiau plačiai paplitęs, pavyzdžiui, tikrinant naujagimius.

Nepriklausomai nuo paimto mėginio tipo, genetinė medžiaga randama ant vatos tampono, skalavimo tirpalo arba kraujo lašelio. Ši mėginio medžiaga siunčiama į laboratoriją, kur ji yra izoliuota ir išgryninama.

Tada PGR testas yra padalintas į du etapus:

• PGR: Šiame etape pradinės genetinės medžiagos kiekis padauginamas.
• Elektroforezė: Antrame etape genomo segmentai yra „surūšiuoti“ pagal dydį. Tokiu būdu galima apibūdinti mėginį - nustatoma smulki genetinės medžiagos struktūra.

1 žingsnis: PGR - „Polimerazės grandininė reakcija“

„PGR“ yra pirmasis iš dviejų darbo etapų: čia padauginamas esamos pradinės DNR kiekis. Nes tik tada, kai genetinės medžiagos yra pakankamai, galima ją ištirti. Dažniausiai tai yra žmogaus DNR; koronaviruso tyrimai atitinkamai yra viruso RNR.

Santrumpa PCR reiškia anglišką terminą „Polymerase Chain Reaction“.

Ko reikia PCR?

Pradinė DNR yra reakcijos inde su specialiomis medžiagomis. Esama genetinė medžiaga yra šablonas, kuris nukopijuojamas esant tam tikriems fermentams (Taq polimerazei) ir tam tikriems pagrindiniams DNR blokams.

Kopijavimo procesas vyksta keliais - pasikartojančiais - ciklais.

Konkrečiai derinamos šios medžiagos:

• Pradinė DNR: mėginio medžiaga, kurią reikia pakartoti.
• Pagrindiniai DNR statybiniai blokai: tai yra nukleobazės adeninas, timinas, citozinas ir guaninas.
• DNR polimerazė: fermentas, jungiantis atskirus DNR blokus, kad sudarytų gerai apibrėžtą DNR grandinę. Naujai gauta kryptis yra veidrodinis (papildomas) originalios pradinės medžiagos vaizdas.
• Buferinis tirpalas: polimerazės grandininė reakcija vyksta fiziologiniame buferiniame tirpale. Tai užtikrina sąlygas, panašias į tas, kurios yra žmogaus ląstelėse. Šis tirpalas palaiko stabilų pH ir jame yra magnio jonų. Šios kontroliuojamos sąlygos yra būtinos norint užtikrinti DNR polimerazės funkcionalumą.
• Pradmenys: juos sudaro 16–24 bazinės poros ir jie tarnauja kaip pradžios padėtis ir pradžios signalas. Pradmenys rodo DNR polimerazę, kurioje (pradinės DNR) kopijavimo procesas prasideda.

Kaip atliekamas PCR tyrimas?

Kadangi visos medžiagos, reikalingos PGR, dabar yra reakcijos inde, gali prasidėti tikrasis genetinės medžiagos kopijavimo procesas. Tai tik pradedama, kontroliuojama ir vėl sustabdoma temperatūra.

Reakcijos indas atitinkamai kaitinamas arba atšaldomas iki skirtingos temperatūros. Tai atliekama naudojant specialų prietaisą - vadinamąjį terminį ciklą. Bendra reakcija trunka apie vieną ar dvi valandas.

Atskiri PGR ciklo etapai yra šie:

• Dvigubos DNR grandinės denatūravimas: mėginys pašildomas iki maždaug 90 laipsnių Celsijaus. Dėl to pradinė dviguba DNR grandinė suskyla į dvi atskiras (papildomas) atskiras grandines.
• Grunto tvirtinimas: temperatūra sumažinama iki šiek tiek žemiau 60 laipsnių Celsijaus. Dėl to pradmenys (pradiniai pradmenys, atvirkštiniai pradmenys) prisitvirtina prie apibrėžtų pozicijų atitinkamose atskirose DNR grandinėse.
• Prailginimas: temperatūra padidinama iki šiek tiek daugiau nei 70 laipsnių Celsijaus. DNR polimerazė dabar pradeda dirbti esant tokiai optimaliai temperatūrai. Jis prisitvirtina prie pradmenų ir žingsnis po žingsnio prailgina pradinę atskirą DNR grandinę, kol bus pasiekta tiksli (papildoma) kopija (DNR sintezė).

Pasibaigus ciklui, temperatūra vėl padidinama iki maždaug 90 laipsnių Celsijaus - ciklas prasideda iš naujo.

Naudojant PGR metodą, DNR sekas galima atkartoti iki maždaug trijų kilobazių porų (kbp). Tai atitinka maždaug 3000 pagrindinių DNR statybinių blokų, susietų suformuojant „grandinę“. Palyginimui: žmogaus genomas planus ir informaciją apie ląstelės veikimą saugo maždaug trijuose milijarduose bazinių porų - kita vertus, koronaviruso genomą sudaro 30 000 bazinių porų. PGR testas gali būti naudojamas tik atgaminti ir ištirti trumpas visos DNR dalis.

Gruntai yra labai svarbūs

Gruntų pasirinkimas yra labai svarbus PGR procesui. Pavyzdžiui, atliekant „Sars-CoV-2“ diagnostiką, naudojami keli pradmenys (daugialypis PGR).

Koronos PGR tyrimuose ieškoma trijų skirtingų virusų genų: bendras specifiškumas padidėja iki beveik 99,99%. Tai reiškia, kad esant tokiam dideliam rezultatų skaičiui, 10 000 tyrimų (jei mėginys paimtas teisingai) yra tik vienas klaidingai teigiamas testas.

Kiek dabar yra nukopijuotos genetinės medžiagos?

Tarkime, kad po pirmojo ciklo yra dvi identiškos dvigubos DNR grandinės.

Po kiekvieno ciklo (nukopijuotos) genetinės medžiagos kiekis padvigubėja. Taigi DNR kiekis auga eksponentiškai.

Kitaip tariant: po antrojo ciklo yra keturios identiškos dvigubos gijos - po trečio ciklo aštuonios dvigubos sruogos - po ketvirtojo ciklo 16 dvigubų gijų ir po penktojo ciklo jau 32 dvigubos sruogos.

Medicinos specialistai paprastai pakartoja šį procesą maždaug nuo dvidešimt iki trisdešimt kartų.

Kalbant metaforiškai, tai reiškia: net jei pradžioje mėginyje buvo rasta tik viena dviguba DNR grandinė, po dvidešimties ciklų reakcijos inde jau bus milijonas identiškų kopijų.

Ką reiškia Ct vertė?

Baigtų PGR ciklų skaičius pateikiamas vadinamosios Ct vertės pavidalu. „Ct“ yra kilęs iš angliško termino „ciklo slenkstis“. Ši Ct vertė leidžia teigti apie ieškomos genetinės medžiagos kiekį.

Esant žemai Ct vertei 20, yra daug pradinės genetinės medžiagos. Tačiau, jei Ct vertė yra didelė - apie 30 ciklų - DNR yra atitinkamai mažai. Todėl PGR ciklą reikia atlikti dažniau.

2 žingsnis: elektroforezė „Rūšiavimas pagal dydį“

Galiausiai, jei yra pakankamai „praturtintos“ genetinės medžiagos, gali įvykti vadinamoji elektroforezė. Mokslininkai naudoja tam tikrą DNR savybę: jos elektros krūvį.

Atskiros DNR statybinės medžiagos yra sujungtos viena su kita per (neigiamai) įkrautą cukraus-fosfato pagrindą. Kuo ilgesnė tam tikra DNR seka, tuo didesnis jos elektros krūvis.

Jei genetinė medžiaga dedama į tam tikrą nešiklio terpę (agarozę) ir įvedama elektros įtampa, DNR segmentai pradeda judėti dėl savo krūvio. Kadangi ilgesnis DNR ruožas keliauja greičiau nei trumpesnis fragmentas, jie atskiriami pagal dydį.

Tokiu būdu galima ištirti ir apibūdinti genetinę medžiagą. Praktiškai nežinomas mėginys su žinoma nuoroda paprastai taikomas „pradžios linijai“ ir palyginamas vienas su kitu po tam tikro laiko.

Jei „migracijos greitis“ yra vienodas abiejose sekose, tai reiškia: labai tikėtina, kad aptikimas yra teigiamas - jūsų ieškomas genas yra mėginyje.

Specialus koronaviruso atvejis: mėginio paruošimas ir RT-PCR

Koronaviruso patogeno aptikimas yra ypatingas atvejis. Sars-CoV-2 yra vienas iš vadinamųjų RNR virusų. Tai reiškia, kad Sars-CoV-2 genomas yra RNR (ribonukleino rūgšties) formos.

RNR nuo DNR skiriasi tik keliais būdais. Be kitų dalykų, jis tiekiamas kaip viena grandinė ir yra pagamintas iš cukraus ribozės, o ne 2 colių dezoksiribozės. Nukleobazės timinas taip pat buvo pakeistas uracilu kaip ketvirtoji bazė.

Ši virusinė RNR turi būti „perrašyta“ į DNR prieš įprastą PGR tyrimą. Šis procesas vadinamas atvirkštine transkripcija (RT) - taigi terminas RT -PCR. Šio proceso metu gaunama viena cDNR grandinė („papildoma DNR“). Tolesniame etape vieną cDNR grandinę papildo antra, veidrodžiu apversta DNR grandinė.

Mėginio paruošimo pabaigoje yra dviguba DNR grandinė, atitinkanti pradinį viruso RNR planą: tik ši dviguba grandinė dabar gali būti naudojama kaip šablonas atliekant PGR tyrimą.

Kiek laiko užtrunka, kol gaunamas rezultatas?

Išsiuntę mėginį į laboratoriją, rezultatą paprastai gausite po vienos ar dviejų darbo dienų.Bandymų centruose, kurie dažnai tiria mėginius vietoje, tai gali užtrukti tik kelias valandas. Laikotarpis labai priklauso nuo atitinkamo bandymų centro ir jo logistikos.

Nepaisant sudėtingų darbo procesų, šiuolaikinės laboratorijos gali atlikti didelio našumo PGR tyrimus. Įdiegti padeda specialūs automatiniai įrenginiai.

PGR testas vis dar laikomas palyginti „lėtu“, bet patikimesniu aptikimo metodu.

Kas atsitiks, jei rezultatas bus teigiamas?

Jei mėginys paimtas teisingai, teigiamas PGR testas reiškia, kad labai tikėtina, kad tirtas asmuo bus užsikrėtęs Sars-CoV-2.

Jei PCR testo pagalba patvirtinta, kad esate užsikrėtęs koronavirusu, sveikatos departamentas gaus atitinkamos laboratorijos pranešimą apie teigiamą testo rezultatą. Tokiu atveju sveikatos departamentas nurodys izoliaciją arba karantiną.

Ar aš automatiškai užkrečiamas, jei gaunu teigiamą PGR testą?

Dažniausiai taip. Bet ne visada. PGR tyrimo rezultatas visada turėtų būti aiškinamas kontekste. Teigiamas testas pirmiausia reiškia, kad turite virusinės medžiagos.

Jei tik neseniai (kelias dienas) sirgote „Covid 19“, PGR testas vis tiek gali būti teigiamas, nors ir vėl esate sveikas. Tai ypatingas atvejis ir labai jautraus testo trūkumas, nes taip pat galima aptikti viruso fragmentų, kurie negali daugintis.

Kartais naudingas papildomas antikūnų tyrimas

Tokiais atvejais antikūnų tyrimas suteikia tikrumo, užtikrinančio PGR tyrimo pagrįstumą. Geriausia tai aptarti su gydytoju. Jie gali padėti teisingai interpretuoti PGR testo rezultatą.

Ką daryti, jei rezultatas yra neigiamas

Neigiamas PGR testo rezultatas reiškia didelę tikimybę, kad imant mėginį nesusirgote „Covid-19“ ir todėl šiuo metu nesate užkrečiamas. Tačiau galite būti ankstyvoje infekcijos stadijoje.

Paprastai koronines infekcijas galima aptikti tik nuo antros ar trečios dienos po užsikrėtimo. Taigi rezultatas nėra nemokamas bilietas. Todėl turėtumėte ir toliau laikytis atstumo ir higienos taisyklių ir toliau dėvėti FFP2 kaukę - sau ir kitiems.

PGR tyrimas vaikams

Vaikų PGR testas nesiskiria nuo suaugusiųjų PGR tyrimo. Atranka ir rezultatų aiškinimas taikomi tiek vaikams, tiek suaugusiems.

Kokia yra PGR tyrimo rizika?

PGR testas nekelia jokios fizinės rizikos. Kai kurie žmonės erzina ar nemaloniai laiko tik mėginių ėmimą nosiaryklės tamponu.

Kiek kainuoja PGR tyrimas?

Visos išlaidos, patirtos atliekant PGR tyrimą, bus padengtos, jei jūsų gydantys gydytojai ar sveikatos departamentas patvirtins tokį tyrimą. Į išlaidų atlyginimą paprastai atsižvelgiama, jei jau turite savo simptomų arba turite tiesioginį kontaktą su užsikrėtusiais žmonėmis.

Net jei teigiamas greitasis arba savęs testas yra teigiamas, turite teisę į nemokamą PGR testą.

Atkreipkite dėmesį: jei išbandėte save namuose ir gavote teigiamą rezultatą, turėtumėte nedelsdami susitarti su šeimos gydytoju telefonu. Gydantis gydytojas su jumis telefonu aptars tolesnę procedūrą.

Arba geriausia paskambinti 116 117, kad užsiregistruotumėte PGR tyrimui. Iki patvirtinimo testo idealiu atveju turėtumėte likti namuose, kad apsaugotumėte save ir kitus.

Žymos:  namų gynimo priemonės neišsipildęs noras turėti vaikų dantų priežiūra